ACEA Quanteon流式细胞仪应用—囊泡(EVs)的检测

 

细胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs)是由哺乳动物的多种类型细胞特别是癌细胞分泌的纳米级膜囊泡,携带和转移蛋白质、mRNA、miRNA和DNA等信号分子。科学研究证明,EVs在体内是长距离细胞间通信的手段,可作为疾病循环生物标志物,在液体活检领域有广泛的应用前景。


流式细胞术因其单细胞水平检测、高灵敏度、多参数、快速、准确等特点,广泛应用于在复杂群体中通过细胞表达的标记区分特定细胞类型。类似地,流式细胞术也可以用于研究囊泡的异质性。然而,囊泡的大小超出了传统流式细胞仪可检测的大小极限。ACEA Quanteon流式细胞仪跨越技术难关,突破传统流式细胞仪在小粒子上的检测极限,配合高灵敏度的荧光检测,可以在单个囊泡水平,通过侧向散射光和荧光,从复杂的群体中区分特定类型的囊泡,助力囊泡的前沿研究。

Quanteon流式细胞仪检测纳米微球

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图 1. ACEA Quanteon流式细胞仪高灵敏度SSC检测纳米微球。A.不同大小空白标准微球(NIST Traceable Size Standards,Bang’s Laboratories)混合后,在Quanteon流式细胞仪上检测。仪器设置:SSC-H增益1,000,FSC-H增益1,000,阈值SSC-H大于1,000。B. ApogeeMix微球(Cat#1493)包含6种不带荧光折射率1.43的微球和两种带绿色荧光折射率1.59的微球,在Quanteon流式细胞仪上检测。仪器设置:SSC-H增益850,FSC-H默认增益,阈值SSC-H大于1,000。C.带荧光标记的Megamix-Plus FSC混合微球和Megamix-Plus SSC混合微球(BIOCYTEX)进一步混合,在Quanteon流式细胞仪上检测。仪器设置:SSC-H增益1,000,FSC-H增益1,000,阈值SSC-H大于1,000。

Quanteon流式细胞仪检测来自血浆的囊泡

血浆中EVs数量丰富,来源有血小板、白细胞、红细胞等,而来自血小板的EVs占比最高。血小板EVs主要由血小板活化后产生,而血小板EVs又进一步增强血小板活化。有研究表明,血液循环中携带血小板特异性标记的EV数量增加与多种病理状态相关,而数量减少则会导致出血倾向。检测血小板囊泡对疾病研究和诊断均有重要意义。本文在体外以ADP刺激全血中血小板活化后,超离法分离无血小板血浆(Platelet Free Plasma,PFP)中的EVs,用Quanteon流式细胞仪检测EV表面CD9、Annexin V以及血小板标记CD61的表达。同时,Quanteon流式细胞仪精确的体积法绝对计数功能可直接反应刺激组和对照组EVs浓度的变化。

采用注射器(针规格 0.7×32 TWLB)行静脉穿刺抽取人外周血,加入柠檬酸钠抗凝管,轻柔颠倒混匀。30分钟内,用200 μM ADP或生理盐水37度处理45分钟。按2500g15分钟离心两次,取上清为PFP。110,000g 90分钟离心两次,获得血浆中囊泡。分出一部分囊泡用1% Triton X-100冰上孵育1小时裂解膜结构作为去除囊泡的对照。CD9 PE-Cy7、CD61 APC、Annexin V FITC标记囊泡后上机检测。抗体和染色缓冲液均预先经20,000g 30分钟离心去除蛋白聚集体等颗粒杂质。

经离心处理的抗体用缓冲液稀释至样本中相同的浓度,在Quanteon上的检测结果可见,抗体中没有阳性颗粒(图3 A)。血浆中检测到CD9阳性、Annexin V阳性或CD61阳性的EVs,三个标记物可共表达,亦可单独表达(图2 D, E)。ADP处理的样本血浆中三种EV浓度远高于对照样本(图2 D, E, F),ADP处理和生理盐水处理后,CD61+ EV的浓度分别为4.48×108 EVs/mL和0.35×108 EVs/mL(图2 F)。采用去污剂(Triton X-100)裂解膜结构是区分检测到的为真实EVs,还是没有膜结构的颗粒的有效方法。此处,用1% Triton X-100处理后,几乎检测不到阳性的EVs(图2 C, F),说明样本中检测到的阳性颗粒均为有膜结构的EVs。
 

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图 2. Quanteon流式细胞仪检测基于2,500g离心上清分离的血浆囊泡。仪器设置:SSC-H增益1000,FSC-H默认增益,阈值SSC-H大于1,000。A. 经20,000g离心30分钟处理的抗体,加入染色缓冲液中检测,浓度与EVs样本中抗体浓度保持一致;B. 未染色EVs样本;C. 1% Triton X-100裂解EVs样本;D. 溶剂处理对照EVs样本;E. ADP处理EVs样本;F. C、D、E中的样本检测到的EVs浓度对比。

与上述来自血小板囊泡的样本处理方法一致,2500g 15min两次离心获取PFP之后,再次以20,000g 30min离心去除其中较大的囊泡,再以相同的方法超速离心获取囊泡并标记囊泡表面CD9 PE-Cy7、CD61 APC、Annexin V FITC,在Quanteon流式细胞仪上检测。

该组样本采用20,000g 30min离心去除了较大的EVs,分离纯化的大部分为尺寸更小的外泌体。该组样本ADP处理和溶剂处理对照之间EVs数量的差异相对较小,ADP处理和生理盐水处理后,CD61+ EV的浓度分别为2.25×107 EVs/mL和1.26×107 EVs/mL。说明由血小板活化产生的大部分EVs尺寸较大。亦说明,采用不同的样本制备方法分析的EVs群体不同,导致不同的结果。将EVs用于体外诊断时,方法的标准化至关重要。

A.
 

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B.

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C.

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图3. Quanteon流式细胞仪检测基于20,000g离心上清分离的血浆囊泡。仪器设置:SSC-H增益1000,FSC-H默认增益,阈值SSC-H大于1,000。A. 溶剂处理对照EVs样本;B. ADP处理EVs样本;C. A和B中的样本检测到的EVs浓度对比。

ACEA Quanteon流式细胞仪跨越技术难关,突破传统流式细胞仪在小粒子上的检测极限,配合高灵敏度的荧光检测,可以在单个囊泡水平,通过侧向散射光和荧光,从复杂的群体中区分特定类型的囊泡,助力囊泡的前沿研究。